HDExaminer™ PRO - 快速准确处理 HDX 实验的范式转变。
HDX-MS 数据分析的简短历史 
在 2010 年代中期，一家名为 Sierra Analytics 的公司发布了一款名为 HDExaminer 的突破性氢氘交换 （HDX） 分析软件（Trajan 随后于 2018 年收购了软件业务）。
虽然它不是第一个专门用于处理 HDX 样本的软件，但与当时的其他 HDX 软件解决方案相比，HDExaminer 具有一些明显的优势.
一个主要优点是它与供应商无关，因此，它可以与各种质谱仪器一起使用。
此外，该软件具有用户友好的 GUI，使 HDX 分析民主化，适用于更广泛的研究人员，他们可能 对编码或使用命令行工具（当时一些现有软件解决方案采用）没有信心。
与此相关的是，包括 HDExaminer 提供的关键视觉功能，例如：
- 氘代水平残渣图，
- 蛋白质状态比较，
- 单个肽摄取图，
- 同位素簇可视化
- 以及颜色编码的置信度。
除了作为处理复杂数据（如重叠峰）和结合严格的统计分析功能等强大平台外，
HDExaminer 可以与 LEAP（现为 Trajan）自动化集成。 这使得从样品制备到分析 的全自动 HDX 实验成为 Trajan CHRONECT HDX 系统成为黄金标准，并在全球许多制药公司、CROS 和研究机构中使用。
troughput 问题 当前大多数 HDX 处理软件解决方案的局限性之一是分析后处理样品所需的时间。
这是一个问题，因为直到最近，该技术还不能用于高通量环境，这限制了它的使用更多地作为研究工具。
每个HDX实验至少需要一天的样品制备和数据采集（LCMS），然后是数天甚至数周的数据处理和验证。
造成这种情况的原因不是由于计算机处理的限制，而是由于需要人工数据管理。这不仅耗时，而且还需要高技能水平才能有效优化 HDX 数据。
此外，由于人类并非万无一失，因此可能会犯错误，导致氘代肽的错误识别和氘摄取值的潜在错误分配。
人类策展数据策展需要这么长时间才能完成，是由于数据采集方法的性质。
从历史上看，这种方法一直仅使用 MS1 维度，而不是最近的 MS2 数据独立采集 （DIA） 方法。
鉴于肽经常共洗脱的短LC梯度面临困难，预计需要仔细检查从仅MS1数据中得出的摄取值。
传统的 MS1 HDX 方法HDX 分析的第一步是使用 MS2-DDA 生成肽图。在获取额外的氘代数据文件 之前，此步骤对于 检查酶解效率和序列覆盖率也是必要的。
创建图谱后，HDExaminer 等软件使用来自 HDX 实验的 MS1 全扫描数据来寻找已知峰，然后跟踪其同位素包络的质心质量偏移，这通常会导致峰展宽。
这是需要人工干预的地方，因为还有其他因素 会导致多发性硬化症峰扩大。 这主要是由于共洗脱肽和光谱噪声干扰氘代肽。
P令人愤慨的是，HDExaminer 等 软件还 不够复杂，无法 仅在 MS1 维度上自动、完全可靠地进行数据管理。
例如，尽管 HDExaminer 具有一些数据校正和管理算法，但通常需要手动检查以确保正确的峰值分配和反卷积。 有时还需要进行 M次年度检查，以验证峰积分并滤除信噪比较差的不良光谱。
此外，由于并非所有峰的行为都相同，因此一些有问题的肽需要单独调整保留时间窗口和/或 m/z 容差。 即使在用户干预的情况下，仍然存在无法解决的显着MS1峰重叠的可能性，从而导致 某些肽的最终丢失。
最后，在反向交换方面，虽然该软件能够使用完全氘代控制来计算此类费率，但手动检查这些计算也是谨慎的做法。
DIA HDX 方法，克服人工数据管理进行 HDX 分析的挑战之一是减轻一种称为氕（在这种情况下通常称为“氢”）/氘扰乱的现象。
在高能环境（例如在碰撞单元中）以及源中的条件足够高能时，也会观察到扰乱。
当这种情况发生时，可交换的氘和氘同位素可以在肽上随机交换位置。这意味着每个原始交换的确切原始位置变得不太清晰，而且肽片段越大，这种现象就会进一步加剧。
尽管有一些解决方案可以缓解源加扰，例如降低源的能量，但这些缓解措施也会对结果的灵敏度产生负面影响。
这一切意味着，直到最近，只有非氘代对照样品（用于肽图创建）被碎片化到 MS2 中，而不是随后的氘代 HDX 样品。
这样做的原因是碰撞池的能量学有可能完全扰乱产离子。额外的摄取测量量即使不是不可能，也会使人类数据管理变得非常成问题，因为有数以万计的额外氘测量（每个片段一个）。
克服传统处理HDX实验方法的问题的一种方法是使用数据独立采集（DIA）方法（蛋白质组学数据分析中相对较新的发展）。
从本质上讲，DIA 对 HDX 同时使用 MS1 和 MS2 数据。DIA 不仅仅依赖保留时间并靶向 MS1 中的特定肽片段（从首先从肽图中识别开始），而是为 HDX 实验增加了另一个复杂性维度。
在 DIA 实验中，质谱分析对所有东西进行碎片化，而不仅仅是特定的目标离子。这是通过将 m/z 范围拆分为大的预定义隔离窗口（例如 20Th）来实现的。
然而，与传统的 DDA 方法不同，传统的 DDA 方法允许选定的前体通过碰撞池以获得该前体特异性的产离子，而 DIA 方法将每个分离（窗口）发送到碰撞池中。
这导致来自该特定窗口的 MS1 中所有前体离子的产离子混合更加复杂。然后，使用蛋白质组学领域的现有方法，软件对每个窗口进行反卷积（使用来自肽数据库的数据），并基本上（计算机）将各个产物离子与其前体配对。
DIA 方法的好处是它更加民主，因为在碰撞诱导解离 （CID） 后允许较低丰度的离子进入 MS2。这意味着鉴定出更多的前体肽，从而获得更解析的肽图。
此外，通过将产离子与其前体配对，还可以提高前体肽鉴定的确定性。
最重要的是，来自完全扰乱的 DIA 片段的额外测量本身就是肽摄取的测量，可以将单个测量值转换为同一摄取的多次测量值。
这种冗余使人们能够使用 MS2 数据认可原始 MS1 肽氘化，或者在 MS1 数据无法解析的情况下覆盖它。最后，由于现代计算机可以快速处理大量数据，因此对人工干预的需求要少得多，这对 HDX 数据解释来说是一个巨大的好处，因此大大加快了流程。
HDExaminer PRO（前身为 AutoHX）使用 DIA 方法进行 HDX 实验 回顾一下，在进行 HDX 实验时，我们正在寻找蛋白质上鰕氘交换较慢或消除的位点。 这为我们提供了有关蛋白质、蛋白质动力学的结构信息，并确定了配体或蛋白质-蛋白质结合的位点，例如表位图谱。
HDX 实验使我们能够将非氘代肽与发生氘化的相同肽进行比较。如果我们在几个时间点重复这个实验，我们就可以了解氘化的速率，并在此过程中识别交换动力学存在差异的热点。
当应用于 LC-MS/MS 分析时，可以创建肽图并相互比较。从历史上看，这是使用上述 MS1 方法实现的，其中将 MS1 中鉴定的氘代肽消化物片段与未氘代对照进行比较。
然后，软件和人类合作识别这些肽并测量其 M/Z 值的正变化，显示恶化程度。
仅MS1方法的最大问题是缺乏与识别肽、其氘化程度以及它们是否被相同M/Z范围的肽污染相关的确定性。
如上所述，其原因是用户和软件必须使用的唯一参考，是前体的原始肽图。
然而，DIA 利用了碰撞池中扰乱的氘 - 氘前体同位素。与使用 DIA 的传统蛋白质组学一样，这些完全扰乱的产物离子然后重新编织在一起（在计算机中）以识别它们的前体离子。通过这样做，阐明了前体氘化程度的统计测量，此外，可以从肽图中识别前体在蛋白质序列中的位置。
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